Tengibúnaður fyrir kraftmikla BIOSENSORS með Y-byggingu amíns 1

Helstu eiginleikar

• Gerir kleift að tengja lífsameindir við frumamín (t.d. NH2-enda, lýsín) við nýja Y-byggingu bindilsþáttar 1 – rautt.
• Þægileg staðlað efnafræði (NHS efnafræði).
• Samhæft við heliX® millistykki.
• Samhæft við proFIRE® hreinsun fyrir hrein bindil-DNA samtengingar (> 5 kDa).
• Hægt er að tengja marga bindla samtímis.
• Gefur > 95% hreint bindil-DNA samtengingu með notandaákvörðuðum gæðum lokaafurðar.
• Inniheldur hvarfefni fyrir þrjár einstakar samtengingarviðbrögð (u.þ.b. 10-50 endurnýjanir hver; allt að hámarki 500).
• Samhæft við sjálfvirkt staðlað endurnýjunarferli.

Verkflæði lokiðview

Þriggja þrepa samtengingarverkflæði

Tímalína: Hendur á tíma < 1 klst | Ræktun ~ 2 klst | Samtals ~ 3 klst

Vörulýsing

Pöntunarnúmer: HK-NYS-NHS-1
Tafla 1. Innihald og geymsluupplýsingar

Efni	Cap	Upphæð	Geymsla
Y-bygging Ligandstrengur 1 NHS	Blár	3 x	-20°C
Buffer A [1]	Gegnsætt	1 x 1.8 ml	-20°C
Buffer C [2]	Gegnsætt	3 x 1.8 ml	-20°C
PE40 biðminni [3]	Gegnsætt	3 x 1.5 ml	-20°C
ddH2O	Gegnsætt	1.5 ml	-20°C
Crosslinker	Brúnn	3 x	-20°C
Hreinsunarsnúningur	Rauður	6 x	2-8°C
2.0 ml hvarfglös fyrir hreinsunarsúlu		6 x	RT
Miðflótta síueining (3 kDa MWCO)[4]		3 x	RT
Miðflóttasöfnunarrör		3 x	RT

Aðeins til rannsóknarnota.
Þessi vara hefur takmarkaðan geymsluþol, vinsamlegast sjá fyrningardagsetningu á merkimiðanum.

MIKILVÆGT
Vörur geta verið sendar við mismunandi hitastig, en geymsla ætti að fylgja leiðbeiningunum sem lýst er í töflunni.
Settið inniheldur hvarfefni sem nægja fyrir fimm samtengingar sem eru um það bil 50-200 µg af lífsameindum hver.
Kvoðasurryn í hreinsunarsnúningssúlunni inniheldur 0.02% natríumazíð.

Viðbótarefni sem krafist er

Tafla 2. Viðbótarefni

Efni	Athugasemdir
Bekkur örskilvinda	Áskilið hraðasvið á bilinu 1,000 xg til 13,000 xg
Vortex
1.5 ml hvarfglös
UV-Vis litrófsmælir (td Nanodrop)	Til að ákvarða Ligandstrengur 1 styrkur samtengda

Allar nauðsynlegar lausnir og biðminni eru innifalin í settinu.

Mikilvægar almennar athugasemdir

• a. Frostþurrkaður Ligand strengurinn er ekki alltaf að finna neðst á rörinu; það gæti verið áfram á rörveggnum eða í rörhettunni. Vinsamlega athugaðu alltaf hvort frostþurrkaða Ligand strengurinn sé til staðar, auðþekkjanlegur á glæru útliti köggla (þú gætir þurft að fjarlægja túpumerkið til að sjá það). Ef það er ekki neðst, vinsamlegast skilið túpunni á miklum hraða í nokkrar mínútur áður en þú leysir upp DNA í biðminni. Að öðrum kosti skaltu setja oddinn á pípettunni nálægt DNA-kúlunni og dreifa jafnalausninni beint á hana; DNA mun fljótt leysast upp.
• b. Þverbindarinn verður tengdur við aðal amínhópana (-NH2) í bindlinum. Aðal amín eru til staðar við N-enda hverrar fjölpeptíðkeðju og í hliðarkeðju lýsín amínósýruleifa.
• c. Forðastu að nota neina stuðpúða sem innihalda aðal amín (þ.e. Tris, glýsín) meðan á samtengingarferlinu stendur (vinsamlegast athugaðu hlutann um samhæfisblað).
• d. Allt að 1 mM af Dithiothreitol (DTT) er hægt að nota meðan á samtengingarferlinu stendur. Forðastu að nota 2-merkaptóetanól eða önnur þíól-undirstaða afoxunarefni meðan á samtengingarferlinu stendur. Ef afoxunarefni er nauðsynlegt er mælt með TCEP í allt að 1 mM.
• e. Forðastu að nota að hluta hreinsað próteinamples eða prótein samples sem innihalda burðarefni (td BSA).
• f. Til að tryggja hámarksávöxtun hvarfsins ætti bindillinn að vera leystur upp í buffer C. Mælt er með skipti á stuðara fyrir samtengingarferlið.
• g. Áður en byrjað er skaltu skilvindu stuttlega í öll rör með bláum, brúnum og gagnsæjum lokum til að tryggja að allt efni sé neðst á rörunum.
• h. Fyrir sameindir með mólþunga um eða undir 5 kDa þarf að gæta sérstakrar varúðar við hreinsunarferlið. Lítil sameindir og sum peptíð hreinsast hugsanlega ekki rétt með meðfylgjandi litskiljunarsúlu. Fyrir frekari upplýsingar, vinsamlegast sendið tölvupóst á support.dbs@bruker.com.
• i. Ef pI próteinsins er < 6, er mælt með lágt pH setti fyrir samtengingu (pöntunarnúmer: HK-NHS-3). Fyrir frekari upplýsingar, vinsamlegast sendu tölvupóst support.dbs@bruker.com.

Þriggja þrepa samtenging lífsameinda við bindilstreng 1

Vinsamlegast lestu alla samskiptaregluna áður en þú byrjar og framkvæmdu öll skref án truflana.

ÁBENDING

Þessa samskiptareglu er hægt að framkvæma samtímis fyrir mörg tengiviðbrögð.
Forðastu að nota að hluta hreinsað próteinamples eða prótein samples sem innihalda burðarefni (td BSA).
Áður en þú byrjar skaltu leyfa þverbindaranum að ná stofuhita fyrir notkun.
Héðan í frá verður Y-byggingu Ligand þráður 1 NHS vísað til sem Ligand þráður 1.

Nanolever breyting

1. Leysið upp bindilstreng 1 í 40 µL af stuðpúða A fyrir notkun, hrærið í vortex þar til öll föst efni eru alveg uppleyst og snúið síðan stuttlega niður.
2. Leysið þverbindarann ​​(brúna lokið) upp með því að bæta við 100 µL af ddH2O, hrærið í vortex þar til öll föstu efnin eru alveg uppleyst og látið síðan snúið niður í stutta stund. MIKILVÆGT: Notið alltaf ferskt efni.
3. Bætið 10 µL af nýútbúnu tengilausninni út í einn skammt af bindilstreng 1. Fargið afganginum af tengilausninni frá skrefi 2.
4. Hvirfðu hvarfefnin í 10 sekúndur, snúðu niður og ræktaðu í 20 mínútur við stofuhita.
   MIKILVÆGT Ekki fara yfir ræktunartímann eða hvarfafraksturinn minnkar.
5. Í millitíðinni skaltu koma jafnvægi á tvær hreinsunarsnúningssúlur (rauð hetta) fyrir eitt tengiviðbragð:
   • a. Fjarlægðu botnþéttingu súlunnar og losaðu hettuna (ekki fjarlægja hettuna).
   • b. Settu súluna í 2.0 ml hvarfglas.
   • c. Skiljið með skilvindu við 1,500 xg í 1 mínútu til að fjarlægja geymslulausnina.
   • d. Bætið 400 µL af stuðpúða C út í plastefnisrúmið í dálknum. Skilvindið við 1,500 xg í 1 mínútu til að fjarlægja stuðpúðann.
   • e. Endurtaktu skref d og fargaðu jafnalausninni sem myndast úr hvarfrörinu. Hreinsunarsnúningssúlan ætti nú að vera í þurru ástandi.
6. Sample hleðsla
   • a. Settu súlurnar frá skrefi 5 í ný 1.5 ml hvarfglös.
   • b. Fjarlægðu hettuna á snúningsdálki númer 1 og notaðu sample frá þrepi 4 til efst á plastefni rúminu.
   • c. Skilvindið við 1,500 xg í 2 mínútur til að safna sample (í gegnumstreymi). Fargið hreinsunarsnúningssúlunni eftir notkun.
   • d. Fjarlægðu hettuna á snúningsdálki númer 2 og notaðu sample frá skrefi c að plastefnisrúminu.
   • e. Skilvindið við 1,500 xg í 2 mínútur til að safna sample (í gegnumstreymi). Fargið hreinsunarsnúningssúlunni eftir notkun.

Ligand samtenging

1. Bætið við u.þ.b. 100 µg (allt að hámarki 200 µg) af bindlinum (styrkur u.þ.b. 0.5 – 50 mg/mL) til sample frá skrefi 6. Notaðu rúmmál sem er u.þ.b. 50 µL.
   EXAMPLE: Stilltu próteinstyrkinn í 2 mg/ml og notaðu 50 µL til samtengingar.
   MIKILVÆGT Gakktu úr skugga um að geymslupúði bindilsins innihaldi engin aðal amín, td Tris-jafna, glýsín (vinsamlegast athugaðu mikilvægar athugasemdir).
2. Blandið hvarfinu með því að pípa upp og niður og láta það hvarfast við stofuhita í að minnsta kosti 1 klukkustund.
   MIKILVÆGT Ekki hvirfla. Ef nauðsyn krefur er hægt að framkvæma hvarfið við 4°C með lengri viðbragðstíma (td yfir nótt).

proFIRE® hreinsun

1. Framkvæmdu hreinsun með því að nota viðeigandi proFIRE® vinnuflæði (vinsamlegast skoðaðu proFIRE® notendahandbókina). Gakktu úr skugga um að samprúmmál lesins er 160 µL.
   1. a. Ef rúmmálið er minna en 160 µL skaltu fylla rúmmálið sem vantar með Buffer A.
      b. Ef rúmmálið fer yfir 160 µL, vinsamlegast framkvæma 160 µL til viðbótar þar til allar sample er neytt.
   2. Notaðu gögnin Viewer hugbúnaður proFIRE® til að bera kennsl á hvaða brot innihalda hreint samtengd.
      FyrrverandiampLitrófið er sýnt í kaflanum um viðbótarupplýsingar: proFIRE® hreinsun á tengiefni úr ligandstreng 1.
   3. Fjarlægðu þau brot sem mælt er með úr brotasafnaranum.

ÁBENDING

Ekki geyma tengingu Ligand-þáttar 1 í langan tíma í proFIRE® hlaupalausninni. Haldið strax áfram með skipti á lausninni.

Buffer Exchange

1. Bætið 500 µL af fyrsta proFIRE® hlutanum sem inniheldur Ligand streng 1 samtenginguna út í miðflótta síueininguna. Skiljið við 13,000 xg (allt að 14,000 xg) í 10 mínútur og hendið í gegnumrennslinu.
2. Bættu hlutunum sem eftir eru í sömu síueininguna og endurtaktu skilvinduskrefið til að safna öllum samples í einu röri. (Vinsamlegast athugaðu Viðbótarupplýsingar: Buffer Exchange and Concentration with Centrifugal Filter Units).
3. Bætið við 350 µL af PE40 (eða TE40, HE40) stuðpúða og skilvindið við 13,000 xg í 10 mínútur. Fargið gegnumflæðislausninni.
   MIKILVÆGT Ef próteinið er ekki stöðugt í PE40 (eða TE40, HE40), vinsamlegast athugaðu biðminni samhæfni með switchSENSE® samhæfisblaðinu.
4. Bætið við 350 µL af PE40 (eða TE40, HE40) stuðpúða og skilvindið við 13,000 xg í 15 mínútur. Fargið gegnumflæðislausninni.
5. Til að endurheimta samtengingu ligandþáttar 1 skal setja miðflúgssíueininguna á hvolf í nýtt miðflúgssöfnunarrör (fylgir með í settinu).
   Snúðu við 1,000 xg í 2 mínútur til að flytja sample í rörið.

Skammtar og geymsla

1. Mælið gleypni tengiefnis ligandþráðar 1 við 260 nm á UV-Vis litrófsmæli (td Nanodrop).
2. Ákvarðið styrk tengiefnis 1-þáttarins (c1) með því að setja inn í eftirfarandi jöfnu:þar sem d er leiðarlengdin (venjulega jöfn 1 cm; vinsamlegast skoðið notendahandbók UV-Vis litrófsmælisins) og  er útrýmingarstuðull DNA við 260 nm, jafnt og 272,000.
3. Fyrir tilbúna lausn fyrir lífflöguvirkni, vinsamlega stilltu styrkinn í 500 nM (eða allt að 1 µM) með PE40 (eða TE40, HE40) jafnalausn (þar á meðal allt að 10% glýseróls, ef þörf krefur) og undirbúið 20 µL skammta.
4. Geymið á milli -86 °C og 8 °C, eins og þú vilt.
   Stöðugleiki lausnarinnar er tengdur stöðugleika bindilsameindarinnar.
   MIKILVÆGT Áður en switchSENSE® víxlverkunarmæling er gerð, vinsamlegast bætið viðeigandi millistykki við samtengda lausnina.

Viðbótarupplýsingar

proFIRE® hreinsun á tengingu Ligand-þráðar 1

1. Til að tryggja bestu niðurstöður úr mælingu ætti enginn frjáls Ligand strengur 1 að vera til staðar á flísinni. Þess vegna verður að hreinsa óhreinan Ligand streng 1 samtengingar með jónaskiptaskiljun fyrir mælingu. Þetta gæðaeftirlitsskref gefur þér frekari gagnlegar upplýsingar um tækin þínample hreinleika.
2. Við mælum með að nota proFIRE® kerfið sem er búið jónaskiptasúlu, Buffer A [1] og Buffer B [5], sem hafa sömu samsetningu en mismunandi saltstyrk, sem gerir kleift að aðskilja toppa.
   MIKILVÆGT Fyrir Y-byggingu Ligand streng 1 – NHS kit, vinsamlegast sláið inn 24 sem DNA lengd (tegund 1) þegar hreinsunarforritið er hafið.
   Á mynd 1 er sýnt dæmigert proFIRE® litróf af hreinsun á tengiefni úr ligandstreng 1, þar sem toppur prótein-DNA tengiefnisins er aðskilinn frá frjálsa próteininu (vinstri) og frjálsa DNA (hægri).
   MIKILVÆGTproFIRE® kerfið er með sérsniðnum hugbúnaði fyrir sjálfvirka greiningu og magngreiningu á DNA-samtengingum.
3. Eftir hreinsun skaltu safna samtengingarhlutunum Ligand streng 1 (Mynd 1: hlutar 8-10), einbeita samtengdu efninu og skiptast á jafnalausn við valinn jafnalausn með því að nota miðflótta síueiningu, eins og lýst er í kafla II.Mynd 1. proFIRE® litróf af hreinsun á tengitengiefni úr bindilstreng. Notaðir stuðpúðar: Stuðpúði A [1]; Stuðpúði B [5].
   Súla: proFIRE® súla. Flæði: 1 ml/mín. Notað forrit: DNA lengd 24, gerð 1.

Buffer Exchange og styrkur með miðflótta síunareiningum

1. Taktu eina miðflótta síueiningu, bættu viðeigandi magni (500 µL) af stuðpúða í síutækið og settu lok á hana.
2. Settu lokuð síubúnað inn í skilvindu snúninginn, stilltu lokarólina í átt að miðju snúningsins; mótvægi með svipuðu tæki.
3. Snúðu tækinu við 13,000 xg (eða 14,000 xg) í tiltekinn tíma.
4. Fjarlægið flæðið og endurtakið skref 1-3 með 350 µL rúmmáli.
5. Fjarlægðu samsetta tækið úr skilvindunni og aðskilið síubúnaðinn frá örskilvindurörinu.
6. Til að endurheimta samtenginguna, settu síubúnaðinn á hvolf í hreint miðflóttarör, stilltu opnu lokinu í átt að miðju snúningsins; mótvægi með svipuðu tæki. Snúðu í 2 mínútur við 1,000 xg til að flytja sample frá tækinu í rörið.

Samhæfisblað

Buffer aukefni
Samtenging bindla með öllum tiltækum tengibúnaði er hægt að framkvæma með mörgum mismunandi aukefnum. Eftirfarandi listi sýnir allar prófaðar, en vinsamlegast athugaðu að aðrir sem ekki eru taldir upp hér gætu einnig verið notaðir með góðum árangri.

* þíól-undirstaða afoxunarefni
** inniheldur aðal amín
*** varúð, getur skaðað bindilinn

pH/pI

pH-gildið fyrir samtengingarbuffinn getur verið á bilinu pH 5.0 til pH 8.0, allt eftir eiginleika bindilsins. Þegar þú framkvæmir samtengingu próteina með pI < 6, vinsamlegast athugaðu að notkun stuðpúðar með lægra pH getur leitt til betri afraksturs af samtengdu.

Buffer	pH	Pöntunarnr	Samsetning
Fosfat-sítrat buffer	pH 5	–	50 mM buffersalt, 150 mM NaCl
Buffer M	pH 6.5	BU-M-150-1	50 mM MES, 150 mM NaCl
Buffer A	pH 7.2	BU-P-150-10	50 mM Na2HPO4/NaH2PO4150 mM NaCl
Buffer C	pH 8.0	BU-C-150-1	50 mM Na2HPO4/NaH2PO4150 mM NaCl

Saltstyrkur
Fyrir staðlaðar samtengingar eru 50 mM stuðpúðarsalt og 150 mM NaCl (eingilt salt) notað.
Þegar þú framkvæmir samtengingu á sterkt hlaðna bindla skaltu ganga úr skugga um að styrkur NaCl sé nægilega hár (mælt er með allt að 400 mM NaCl). Annars getur útfelling DNA átt sér stað.
Skjaldandi áhrif eingildra natríumkatjóna leiða til stöðugleika DNA með því að hlutleysa neikvæðu hleðsluna á sykurfosfathryggnum.

Gagnleg pöntunarnúmer

Tafla 3. Pöntunarnúmer

Vöruheiti	Upphæð	Pöntunarnr
Y-bygging Amín tengibúnaður 2 – Grænn	3 samtengingar	HK-NYS-NHS-2
Miðflótta síueining (10 kDa MWCO)	5 stk.	CF-010-5
10x Buffer A [1]	50 ml (gefur 500 ml)	BU-P-150-10
5x Buffer B [5]	50 ml (gefur 250 ml)	BU-P-1000-5
1x Stöðva C [2]	12 ml	BU-C-150-1

Hafðu samband

Dynamic Biosensors GmbH
Perchtinger Str. 8/10 81379 München Þýskalandi

Bruker Scientific LLC
Manning Road 40, Manning Park, Billerica, MA 01821 Bandaríkin

Upplýsingar um pöntun order.biosensors@bruker.com
Tæknileg aðstoð support.dbs@bruker.com

www.dynamic-biosensors.com
Tæki og örgjörvar eru hannaðir og framleiddir í Þýskalandi. ©2025 Dynamic Biosensors GmbH
Aðeins til rannsóknarnotkunar. Ekki til notkunar í klínískum greiningaraðgerðum.

1. Buffer A: 50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.2
2. Buffer C: 50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8.0
3. Buffer PE40: 10 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 40 mM NaCl, pH 7.4, 0.05% Tween, 50 µM EDTA, 50 µM EGTA
4. Fyrir samtengingu próteina með mólmassa hærri en 20 kDa: Hægt er að panta miðflótta síueiningar með MWCO 10 kDa fyrir hraðari styrkingarferli (pöntunarnúmer: CF-010-5).
5. Buffer B: 50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 1 M NaCl, pH 7.2

www.dynamic-biosensors.com

Skjöl / auðlindir

Tengibúnaður fyrir kraftmikla BIOSENSORS með Y-byggingu amíns 1 [pdfNotendahandbók HK-NYS-NHS-1, Y-bygging amín tengibúnaðarsett 1, amín tengibúnaðarsett 1, tengibúnaðarsett 1, sett 1

Heimildir

• Notendahandbók